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Expression in E.coli
name: Klicken Sie hier, um Text einzugeben. , date: Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.

Materials

LB Media / 1L

ZY Media 928mL/L for auto-induction

20x NPS 50mL/L

50x 5052 20mL/L

2mM MgSO 4

1000x trace-elements 0.2mL/L

10g Peptone

10g Peptone

1M Na 2 HPO 4

25% Glycerol

1M MgSO 4

50mM FeCl 3

5g Yeastextract

5g Yeastextract

1M KH 2 PO 4

2.5% Glucose

 

20mM CaCl 2

10g NaCl

 

0.5M (NH 4 ) 2 SO 4

10% a-Lactose

 

10mM MnCl 2

 

 

 

 

 

10mM ZnSO 4

 

 

 

 

 

2mM CoCl 2

 

 

 

 

 

2mM CuCl 2

 

 

 

 

 

2mM Na 2 MoO 4

 

 

 

 

 

2mM Na 2 SeO 3

 

 

 

 

 

2mM H 3 BO 3

glass

plastic

baffled

unbaffled

table 01 - components for LB or Auto Inducing Media

- LB-Media will be autoclaved in the flasks
- Auto Inducing Media (AIM) will be autoclaved without the additional ingredients. They will be sterile filtred
  only.
- fresh transformation of plasmid with expression host of interest on LB-Agar with desired selection marker
  or glycerol stock
Klicken Sie hier, um Text einzugeben. (e.g. BL21(DE3)::plasmid::GOI)
- 2x 100mL LB in 250mL flasks for overnight culture

LB Media: - 6 – 12x 0.5L in 2L flasks, Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
                   - 1M IPTG
                   - 3 – 6mL selection marker Wählen Sie ein Element aus.

AIM: - 6 – 12x 464mL in 2L flasks, Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
          - all other ingredients will be added before inoculating with overnight culture
          - 3 – 6mL selection marker Wählen Sie ein Element aus.


 

1x preweight 50mL Falcon Tube per 2L cell pellet, Klicken Sie hier, um Text einzugeben. mL 1x PBS - ice cold, liquid Nitrogen

Equipment
Avanti JXN-26 #2, 1000mL bottles  for cell harvesting
S1 Eppendorf 5920R for cell washing with PBS
Incubator

Innova S441 Top

Innova S441 Mid

Innova S441 Bottom

Innova 4400 Top

Innova 4400 Bottom


Preparations: - please ensure all materials needed are available in sufficient amounts
                         - please book all equipment needed online in PPMS (webinterface or QR codes)



Day 1, date Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.
Overnight culture
- pick single colony from transformation on LB-Agar plate, date Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.
- or scrape some small amount from glycerol stock, date Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.
- transfer into 100mL LB supplemented with selection marker each
- growth at 37°C, Klicken Sie hier, um Text einzugeben. RPM (e.g. 180) overnight in Incubator

Day 2, date Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.
Mainculture LB
- add selection marker to 500mL LB in 2L flasks
- measure OD 600 of Overnight culture (1:10 dilution): Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- inoculate with overnight culture to an OD 600 = 0.1 (C1xV1 / C2xV2)
  OD 600 = 0.1 x 500mL / OD 600 = Klicken Sie hier, um Text einzugeben. x V2
  V2= Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- Notes: Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- growth at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. °C and Klicken Sie hier, um Text einzugeben. RPM in Incubator until OD 600 = Klicken Sie hier, um Text einzugeben. (e.g. 37°C, 180 RPM, OD 600 =0.6)

Time

OD 600

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


- take 1mL sample for SDS PAGE analysis, freeze in -20°C
- induce protein expression with Klicken Sie hier, um Text einzugeben. mM IPTG final concentration (e.g. 0.1 – 1mM)
- continue growth for Klicken Sie hier, um Text einzugeben. h at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. °C
  and Klicken Sie hier, um Text einzugeben. RPM, overnight possible (e.g. 4h, 30°C, 180 RPM)
- Notes: Klicken Sie hier, um Text einzugeben.


Mainculture Auto Inducing Media
- add selection marker to 464mL media in 2L flasks
- add 25mL/464mL 20x NPS
- add 10mL/464mL 50x 5052
- add 1mL/464mL 1M MgSO 4
- measure OD 600 of Overnight culture (1:10 dilution): Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- inoculate with overnight culture to an OD 600 = 0.1 (C1xV1 / C2xV2)
  OD 600 =0.1 x 500mL / OD 600 = Klicken Sie hier, um Text einzugeben. x V2
  V2= Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- Notes: Klicken Sie hier, um Text einzugeben.
- growth at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. °C and Klicken Sie hier, um Text einzugeben. RPM in incubator until OD 600 = Klicken Sie hier, um Text einzugeben. (e.g. 37°C, 180 PM, OD 600 =0.8)


 

Time

OD 600

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 

 


- take 1mL sample for SDS PAGE analysis, freeze in -20°C
- induce protein expression by setting temperatur to 30°C/20°C
- continue growth for Klicken Sie hier, um Text einzugeben. h at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. °C and Klicken Sie hier, um Text einzugeben. RPM overnight (e.g. 16h, 20°C, 180 RPM)
- Notes: Klicken Sie hier, um Text einzugeben.



Day 2/3, date Klicken Sie hier, um ein Datum einzugeben.
Mainculture LB
- before harvesting check OD 600

Time

OD 600

 

 

- take 1mL sample for SDS PAGE analysis, freeze in -20°C

Mainculture Auto Inducing Media
- bevore harvesting check OD 600

Time

OD 600

 

 

 

1

2

3

4

50mL falcon tube empty

 

 

 

 

------“------       With cells

 

 

 

 

Wet Cell Mass

 

 

 

 

- take 1mL sample for SDS PAGE analysis, freeze in -20°C

Harvesting
- transfer expression culture into 1000mL bottles for Avanti JXN-26 #2
- balance tubes correctly
- harvest cells at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. xg for Klicken Sie hier, um Text einzugeben. min at Klicken Sie hier, um Text einzugeben. °C (e.g. 5000xg, 15min, 4°C)




please note: supernatants will be kept in expression flasks for autoclaving, do not put them into the sink
- weigh 50mL falcon tubes to calculate wet cell mass
- discard supernatant and scrape out cell pellet with soft spatula
- transfer two cell pellets into one 50mL falcon tube
- add 30mL icecold 1x PBS per 50mL falcon tube and resuspend by pipetting
- pellet cells again by centrifuging at 3234xg  for 30min at 4°C
- disard supernatant and freeze pellets with liquid Nitrogen and keep at -80°C unti further use

 

 

Results

Liters medium

 

Amount cells

 

Amount cells per Liter